Методика проведения электрофореза
3. Полиакриламидные гели
Полиакриламидные гели образуются при сополимеризации акриламида (АА) и бис-акриламида (N,N′-метиленбисакриламид, МБА, или просто “бис”). Реакция полимеризации проходит по свободнорадикальному механизму за счёт объединения винильных групп и носит цепной характер. Полимеризация инициируется персульфатом аммония (ПА): NH4–SO4–SO4–NH4, который при растворении в воде подвергается гомолитическому расщеплению по связи между атомами кислорода. В результате образуются два достаточно долго живущих радикала с одним неспаренным электроном у атома кислорода NH4–SO4˙. Скорость образования свободных радикалов из ПА можно увеличить путём добавления в раствор ТЕМЕД (N,N,N′,N′- тетраметилэтилендиамин, (CH3)2N–CH2–CH2–N(CH3)2), который, таким образом, служит катализатором реакции полимеризации. Свободные радикалы ПА взаимодействуют с мономерами акриламида, приводя к разрыву двойной связи и превращая их в свободные радикалы. Последние, в свою очередь взаимодействуют с неактивированными мономерами с образованием нового радикала, давая, таким образом, начало цепной реакции полимеризации. Цепная реакция идёт до тех пор, пока не встретятся два радикала, которые после взаимодействия образуют обычную ковалентную связь. В растущую полимерную цепь по аналогичному механизму могут встраиваться случайным образом молекулы бис-акриламида. Имея в своём составе две винильных группы на разных концах молекулы, МБА может оказаться встроенным в две различные полимерные цепочки, образуя между ними сшивку (рисунок 1). Это приводит к образованию пористого геля, размер пор которого зависит от условий полимеризации и концентрации мономеров растворе.
рис.1
Источником свободных радикалов также может служить рибофлавин, нередко используемый вместе с ПА и ТЕМЕД. Под действием света он присоединяет водород и восстанавливается до лейкорибофлавина, который, в свою очередь, окисляется в присутствии кислорода с образованием перекиси водорода. Разложение перекиси приводит к образованию OH˙ радикалов, которые дают начало полимеризации акриламида. Такой механизм часто называют фотохимической полимеризацией.
рис 2 . фото: сканирующая электронная микроскопия (Hitachi S4500) 7,5% ПААГ (а) изнутри _150нм; (B) на поверхности_400нм. Источник: Yuan C., Rhoades E., Heuer D.M., Saha S., Lou X.W., Archer L.A. (2006) Comprehensive Interpretation of Gel Electrophoresis Data. Analytical Chemistry, 78(17), 6179-6186.
Кислород уничтожает свободные радикалы, и поэтому раствор геля обычно дегазируют (еще до использования раствор геля помещают на короткое время в вакуум для удаления растворенного воздуха). Дегазирование раствора геля служит и другой цели. Полимеризация акриламида — экзотермическая реакция (т. е. протекает с выделением тепла), и нагревание геля при его отвердевании может сопровождаться высвобождением пузырьков воздуха, которые остаются включенными в полимеризующийся гель. Дегазирование предотвращает это.
Фотополимеризация представляет собой альтернативный метод полимеризации акриламидного геля. Персульфат аммония и ТЕМЕД заменяют рибофлавином, а залитый гель помещают на яркий свет на 2-3 ч. Фоторазложение рибофлавина происходит с образованием свободных радикалов, инициирующих полимеризацию.
Акриламидные гели характеризуют, указывая долю акриламида; размер пор в геле может варьировать в результате изменения концентрации как акриламида, так и бисакриламида. Акриламидный гель готовят с содержанием акриламида от 3% до 30%.
Таким образом, гель с низким содержанием акриламида (4%) имеет поры большого размера и используется, например, для электрофореза белков, когда требуется свободное движение белков, например для изоэлектрофокусирования или в концентрирующем полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS, sodium dodecyl sulfate). Низкопроцентные акриламидные гели также используются для разделения ДНК. Гели с содержанием акриламида 10-20% применяют в таких методах, как гель-элекрофорез с SDS, где поры малого размера выполняют роль сита, пропуская молекулы небольших белков.