Дифференцировка лимфоцитов

2. Доантигенная дифференцировка лимфоцитов

2.3. Механизм рекомбинации

Материал из Википедии

Количество генных сегментов и разнообразие перестроек

Организация локусов генов иммуноглобулинов в геноме человека

Каждый из локусов Ig/TCR содержит определенное количество сегментов V, D и J, расположенных в определенном порядке: сначала идут повторяющиеся V-сегменты, затем D, если они есть, затем J-сегменты и константный регион (С). Часть генных сегментов является псевдогенами, большинство — функциональными генами, то есть транслируются в белок. Количество вариантов случайных комбинаций генных сегментов в процессе V(D)J-рекомбинации определяет комбинативное разнообразие антигенных рецепторов лимфоцитов.

Механизм[править | править вики-текст]

Молекулярный механизм рекомбинации всех семи локусов Ig/TCR идентичный. Эти генные перестройки происходят на ранних этапах дифференцировки лимфоцитов в костном мозге (для В-лимфоцитов) и тимусе (для Т-лимфоцитов) и представляют собой соматическую негомологичную рекомбинацию, в результате которой генные сегменты V, D и J сближаются, а промежуточная последовательность удаляется. Для локусов IGH@, TCRD, TCRB перестройка протекает в два этапа: сначала сближаются сегменты D и J, а затем происходит соединение V-DJ. Для остальных генов перестройка V-J происходит в один этап.

Сигнальные последовательности[править | править вики-текст]

Рекомбинация происходит по сигнальным последовательностям ДНК, непосредственно прилегающим к генным сегментам. Эти консервативные сигнальные последовательности называются RSS (англ. recombination signal sequence) и состоят из семи нуклеотидов — 5’-CACAGTG-3’ (гептамер), за которым следует последовательность из 12 или 23 нуклеотидов — спейсер, и ещё одного консервативного блока из девяти нуклеотидов — 5’-ACAAAAACC-3’. Последовательность спейсера может варьировать, но длина консервативна и соответствует одному (12 нуклеотидов) или двум (23 нуклеотида) виткам двойной спирали ДНК. Перестройка происходит только между двумя RSS, одна из которых имеет спейсер 12 пар нуклеотидов, другая — 23 п. н., так называемое «правило рекомбинации 12/23». Эта закономерность строения RSS определяет правильную последовательность рекомбинации: например ген IGH@ имеет RSS длиной 23 п. н. на 3’-конце каждого V-сегмента, RSS длиной 12 п. н. на 3’- и 5’-конце каждого D сегмента и RSS длиной 23 п. н. на 5’-конце каждого J-сегмента. Таким образом, V-J-реаранжировка этого локуса невозможна^[6].

V(D)J-рекомбинация представляет собой ряд последовательных реакций сближения, разрывов и воссоединений двойной спирали ДНК и протекает в два этапа. На первом этапе продукты генов RAG1 и RAG2 (англ. recombination activation genes) — распознают RSS и связываются с ними. В формировании комплекса участвуют белки HMG-1 и 2 (high mobility group proteins). Рекомбиназы вносят однонитевой разрыв в ДНК на 5’-конце консервативной последовательности и активируют 3’-OH конец кодирующего сегмента, который фосфатную связь во второй нити ДНК с образованием ковалентно замкнутой шпильки на конце сегмента и «тупых» концов гептамера. Первый этап требует присутствия ионов Mg²⁺.

На втором этапе реакции тупые концы гептамеров соединяются, образуя так называемое сигнальное соединение. Кодирующие концы перед объединением подвергаются процессингу. Шпилька расщепляется в случайном месте, оставляя иногда палиндромную последовательность, называемую Р-нуклеотидами, на конце генного сегмента. Перед воссоединением генных сегментов концы ДНК могут немного деградировать при участии экзонуклеаз, а также происходит нематричное добавление нуклеотидов терминальной дезоксинуклеотидил-трансферазой (англ. TdT) — так называемых N-нуклеотидов. Наконец, кодирующие концы объединяются. Подобный механизм перестройки называют негомологичной рекомбинацией (англ. NHEJ, non-homologous DNA end-joining). Помимо RAG-рекомбиназ в процессе участвуют другие белки системы репарации/рекомбинации: Artemis осуществляет открытие шпильки, DNA-PK связывается с Artemis для обработки кодирующего конца, белки Ku70 и Ku80связывают и репарируют двухнитевые разрывы ДНК, белок XRCC4 и ДНК-лигаза IV соединяют кодирующие концы^[5][7].

Перестройка может протекать по двум механизмам. В случае наиболее типичной делеционной перестройки ДНК между двумя RSS «выпетлевывается», отрезается и образует кольцевой продукт. Инвертированная перестройка возможна, когда сегмент V находится в инвертированном состоянии. В этом случае последовательность, разделяющая две RSS, остается в инвертированном состоянии. Такой тип рекомбинации наиболее характерен для локуса IGK@ (около половины V-J-реаранжировок этого гена). Рекомбинация в норме возможна только между двумя RSS, локализованными на одной хромосоме.^[6]

Вариабельность[править | править вики-текст]

Средняя длина генного сегмента V — 300, J — 46-63, D — 17-37 пар нуклеотидов. В процессе перестройки концы генных сегментов могут потерять несколько нуклеотидов, затем они достраиваются случайными нуклеотидами при помощи фермента терминальной дезоксинуклеотидил-трансферазы (англ. TdT). Такие случайные нуклеотиды называются нематричными (N), поскольку они синтезируются без матрицы ДНК и не присутствуют в геноме человека. В каждом акте соединения может быть добавлено от 1 до 30 N-нуклеотидов. Место соединения V, D и J называется соединительным участком, и кодирует третью гипервариабельную петлю белковой цепи вариабельного домена иммуноглобулина, находящегося в антиген-связывающем центре рецептора. Неточность соединения генных сегментов и добавление нематричных нуклеотидов является источником вариабельности, которое увеличивает антиген-распознающий репертуар на несколько порядков. Наибольшая вариабельность возникает при рекомбинации генов IGH@ и TCRB