Методика проведения электрофореза

1. Общая теория электрофореза.

Общая теория электрофореза.

Многие биомолекулы, такие, как аминокислоты, пептиды, белки и нуклеиновые кислоты, со­держат ионизующиеся группы, поэтому в растворе они могут су­ществовать в заряженной форме, в виде катионов (+) либо анионов (—).

Кроме того, молекулы с близкими по величине зарядами, но различающимися молекулярными весами отличаются друг от дру­га отношением заряда к массе.

На этих различиях осно­вано разделение ионов при движении их в растворе под действи­ем электрического поля (электрофо­реза).

Электрофо­рез - движение заряженных частиц в электрическом поле под действием кулоновских сил, действующих между частицей и полем.

Транспорт заряженной частицы под действием электрического поля назы­вается электрофоретической подвижностью. Электрофо­ретическая подвижность μ может быть определена как скорость на единицу электрического поля (μ выражается в см²•сек^-1•В^-1 )

μ = v/Е  и, следовательно, Q = μ/f.

Q-заряд, f-коэффициент поступательного трения макромолекулы, Е-электрическое поле, v-скорость частицы.

2. Разделения белков методом SDS-PAG-электрофореза

Электрофорез белков в полиакриламидном геле – это метод разделения смесей белков в полиакриламидном геле в соответствии с их электрофоретической подвижностью. Этот способ фракционирования белков и пептидов широко применяется в современной биохимии, молекулярной биологии, генетике. Существует большое количество модификаций электрофореза белков в полиакриламидном геле, предназначенных для решения различных задач и для разных белков и пептидов. Наиболее распространённой разновидностью является электрофорез белков в полиакриламидом геле в присутствии додецилсульфата натрия по Лэммли (англ. SDS-PAAGE).

На данном этапе важно правильно подобрать условия для проведения электрофореза, а именно концентрацию полиакриламида для концентрирующего и разделяющего гелей. Так, в концентрирующем геле концентрация полиакриламида может колебаться от 2 до 8%, а в разделяющем геле – от 5 до 20%. Выбор плотности геля зависит от молекулярных масс исследуемых белков.

3. Полиакриламидные гели

Полиакриламидные гели

Полиакриламидные гели образуются при сополимеризации акриламида (АА) и бис-акриламида (N,N′-метиленбисакриламид, МБА, или просто “бис”). Реакция полимеризации проходит по свободнорадикальному механизму за счёт объединения винильных групп и носит цепной характер. Полимеризация инициируется персульфатом аммония (ПА): NH₄–SO₄–SO₄–NH₄, который при растворении в воде подвергается гомолитическому расщеплению по связи между атомами кислорода. В результате образуются два достаточно долго живущих радикала с одним неспаренным электроном у атома кислорода NH₄–SO₄˙. Скорость образования свободных радикалов из ПА можно увеличить путём добавления в раствор ТЕМЕД (N,N,N′,N′- тетраметилэтилендиамин, (CH₃)₂N–CH₂–CH₂–N(CH₃)₂), который, таким образом, служит катализатором реакции полимеризации. Свободные радикалы ПА взаимодействуют с мономерами акриламида, приводя к разрыву двойной связи и превращая их в свободные радикалы. Последние, в свою очередь взаимодействуют с неактивированными мономерами с образованием нового радикала, давая, таким образом, начало цепной реакции полимеризации. Цепная реакция идёт до тех пор, пока не встретятся два радикала, которые после взаимодействия образуют обычную ковалентную связь. В растущую полимерную цепь по аналогичному механизму могут встраиваться случайным образом молекулы бис-акриламида. Имея в своём составе две винильных группы на разных концах молекулы, МБА может оказаться встроенным в две различные полимерные цепочки, образуя между ними сшивку (рисунок 1). Это приводит к образованию пористого геля, размер пор которого зависит от условий полимеризации и концентрации мономеров растворе.

рис.1

Источником свободных радикалов также может служить рибофлавин, нередко  используемый вместе с ПА и ТЕМЕД. Под действием света он присоединяет водород и восстанавливается до лейкорибофлавина, который, в свою очередь, окисляется в  присутствии кислорода с образованием перекиси водорода. Разложение перекиси приводит к образованию OH˙ радикалов, которые дают начало полимеризации акриламида. Такой механизм часто называют фотохимической полимеризацией.

рис 2 . фото: сканирующая электронная микроскопия (Hitachi S4500) 7,5% ПААГ  (а) изнутри _150нм; (B) на поверхности_400нм. Источник: Yuan C., Rhoades E., Heuer D.M., Saha S., Lou X.W., Archer L.A. (2006) Comprehensive Interpretation of Gel Electrophoresis Data. Analytical Chemistry, 78(17), 6179-6186.

Кислород уничтожает свободные радикалы, и поэтому раствор геля обычно дегази­руют (еще до использования раствор геля помещают на короткое время в вакуум для удаления растворенного воздуха). Дегазирование раствора геля служит и другой цели. Полимеризация акриламида — экзотерми­ческая реакция (т. е. протекает с выделением тепла), и нагревание геля при его отвердевании может сопровождаться высвобождением пузырьков воздуха, которые остаются включенными в полимеризующийся гель. Де­газирование предотвращает это.

Фотополимеризация представляет собой альтернативный метод по­лимеризации акриламидного геля. Персульфат аммония и ТЕМЕД заме­няют рибофлавином, а залитый гель помещают на яркий свет на 2-3 ч. Фоторазложение рибофлавина происходит с образованием свободных ра­дикалов, инициирующих полимеризацию.

Акриламидные гели характеризуют, указывая долю акриламида; раз­мер пор в геле может варьировать в результате изменения концентрации как акриламида, так и бисакриламида. Акриламидный гель готовят с со­держанием акриламида от 3% до 30%.

Таким образом, гель с низким содер­жанием акриламида (4%) имеет поры большого размера и используется, например, для электрофореза белков, когда требуется свободное движение белков, например для изоэлектрофокусирования или в кон­центрирующем полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS, sodium dodecyl sulfate). Низкопроцентные акриламидные гели также используются для разделения ДНК. Гели с содержанием акриламида 10-20% применяют в таких методах, как гель-элекрофорез с SDS, где поры малого размера выполняют роль сита, пропуская молекулы небольших белков.

4. Растворы для ПААГ

30% раствор мономеров (акриламид /бисакриламид) хранить при 4°С в темном месте  до 30 дней

1,5 Мтрис- HCl буферрН 8,8 (для разделяющего геля) хранить при 4°С

0,5 М трис-HCl буфер рН 6,8 (для концентрирующего геля) хранить при 4°С

10% раствор SDS (10 г SDS +60 мл дист. воды, аккуратно растворить без образования пены,  затем довести до 100 мл дист. водой)

 10% раствор персульфата аммония (100 мг ПА на 1 мл воды, готовить непосредственно перед использованием! каждый раз новый!)

50% р-р глицерина

0,5% бромфеноловый синий (БФС)

Буфер для пробы (Vобщ =9,5 мл):

2 мл 10% SDS,

1,25 мл 0,5 М трис-HCl буфер рН 6,8,

2,5 мл глицерина, 

0,2 мл 0,5% БФС,

3,55 мл дист. воды                                         

Хранить при комнатной температуре!

Акриламид мономер - нейротоксин!!! Работать с раствором в перчатках!!!

Взвешивать в маске!!!

Акриламид постепенно гидролизуется до акриловой кислоты и аммиака – не хранить более

30 дней (обязательно проставить дату на этикетке!).

5. Приготовление геля

Для приготовления 10 мл мономера:

Компоненты раствора следует перемешать тщательно, но осторожно, не допуская образования пузырей. Персульфат

аммония и TEMED добавляют последними - именно эти два компонента инициируют полимеризацию
акриламида.

6. Подготовка образца

Буфер для пробы (Vобщ =9,5 мл):

2 мл 10% SDS,

1,25 мл 0,5 М трис-HCl буфер рН 6,8,

2,5 мл глицерина,

0,2 мл 0,5% БФС,

3,55 мл дист. воды                                         

-Перед использованием добавить 50 мкл β-меркаптоэтанол или ДТТ к 950 мкл буфера для пробы

Растворить пробу в буфере в соотношении 1:2 и инкубировать при температуре 100°С в течение 5 минут. 

(Важно! буфер после добавления β-меркаптоэтанола или ДТТ хранить только в холодильнике!)

В карман геля вносить 20 мкл пробы.

7. Подготовка камеры для геля

Вымыть камеры детергентом, хорошо сполоснуть;

Собрать "сэндвич" из стеклянных пластин,

Загерметизировать низ камеры для геля

Закрепить ее вертикально непосредственно на форезном столике,

 Приготовленную смесь РГ 10% аккуратно залить между стекол, закрепленных

вертикально в аппарате для электрофореза на 2/3. За полимеризацией наблюдать по оставшемуся в пробирке раствору. На поверхность геля наслоить насыщенный концентрирующим буфером изобутанол (если это допускает инструкция к форезному аппарату) или воду слоем не менее
5 мм (полимеризация акриламида не идет в присутствии кислорода) и оставить гель для полимеризации не менее чем на 15-25 минут;

Затем убрать воду 

и залить КГ 5% , вставить гребенку и оставить гель для полимеризации не менее чем на 15-25 минут; 

За полимеризацией наблюдать по оставшемуся в пробирке раствору.

8. Сборка установки для электрофореза

ВНИМАНИЕ!!! БУФЕР ПОСЛЕ ПРОЦЕДУРЫ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА АККУРАТНО СЛИТЬ В ЕМКОСТЬ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ И УБРАТЬ В ХОЛОДИЛЬНИК!!! (БУФЕРНЫЙ РАСТВОР МНОГОРАЗОВОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ!!!)

9. Фиксация и окраска геля

После окончания электрофореза сразу выполнить фиксацию! (обязательно перед окраской!)

Поместить гель в раствор для фиксации на 10-15 мин: 25 мл ледяной уксусной кислоты: 50 мл этанола : 25мл дистиллированной воды.

Окрашивание геля с помощью красителя  Coomassie Brilliant Blue R-250 (чуствительность 0.3-1.0 p,g белка).

 Поместить гель в раствор для окрашивания (Кумасси R 250 + уксусная кислота) на 30 мин.

Затем в отмывочный р-р на 24 ч (метанол + ледяная уксусная)

ВНИМАНИЕ!!! ВСЕ РАСТВОРЫ: ДЛЯ ФИКСАЦИИ, ОКРАСКИ И ОТМЫВКИ -МНОГОРАЗОВОГО ИСПОЛЬЗОВАНИЯ! ПОСЛЕ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ АККУРАТНО СЛИВАТЬ В ЕМКОСТЬ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ! ВНИМАТЕЛЬНО СМОТРИТЕ ЧТО НАПИСАНО НА ЕМКОСТИ ДЛЯ ХРАНЕНИЯ!!! 

В КОМНАТЕ ГДЕ ВЫПОЛНЯЕТСЯ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ ПОСЛЕ ОКОНЧАНИЯ РАБОТЫ ДОЛЖНА БЫТЬ ЧИСТОТА!