Мониторинг мутагенного загрязнения окружающей среды (профиль Генетика)
Topic outline
-
Цели генетического мониторинга. Задачи генетического мониторинга. Подходы к генетическому мониторингу.
-
Действие физических факторов на наследственный аппарат клетки. Классификация мутагенных факторов. УФ-излучение, ЭМ-излучение, СВЧ-излучение, КВЧ-излучение, УВЧ-излучение, ИК-излучение, оптическое излучение.
-
Нитроароматические компоненты, полиароматические гидрокарбонаты, полициклические ароматические амины, нитрозамины, тяжелые металлы, пестициды. Действие металлов на наследственный аппарат клетки.
-
Анализ мутаций на генном уровне, цитогенетический анализ тканей растений, флуоресцентная in situ гибридизация, анафазный метод и микроядерный тест, алкалиновый метод комет, определение флуктуирующей асимметрии растений.
-
Выявление структурных и количественных аберраций хромосом, метод флуоресцентной гибридизации in situ, микроядерный тест.
-
Комета-тест, гель-электрофорезный тест, обнаружение аддуктов ДНК.
-
Salmonella typhimurium (тест Эймса), Saccharomyces cerevisae (альфа-тест).
-
Особенности растительных организмов, позволяющие их использовать в качестве тест-систем. Наиболее часто используемые в скрининге мутагенов растительные тест-системы. Оценка качества окружающей среды с помощью традесканции (мутации в клетках тычиночных нитей, микроядерный тест). Дрозофила – объект для исследования мутагенности токсикантов (метод Меллер-5).
-
Понятие об экологической генетике. Основные направления генетического мониторинга природных популяций. Хлорелла – объект для проведения исследований динамики мутационного процесса в популяциях. Закономерности мутационного процесса в радиоактивно облучаемых популяциях. Реакция популяции на стресс.
-
Методы изучения генетической структуры популяций. Исследование мутационного процесса в половых клетках человека и снижение генетического груза популяции.
-
Оценка миграционных потоков аллелей. Оценка мутагенеза в соматических клетках человека.
-
Общий статус трансгенных культур в мире. Риски, связанные с интродукцией трансгенных растений в окружающую среду. Основные методы генетического мониторинга трансгенов.
-
Цели генетического мониторинга. Задачи генетического мониторинга. Подходы к генетическому мониторингу.
-
Классификация мутагенных факторов. Физические факторы: УФ-излучение, ЭМ-излучение, СВЧ-излучение, КВЧ-излучение, УВЧ-излучение, ИК-излучение, оптическое излучение. Химические факторы: нитроароматические компоненты, полиароматические гидрокарбонаты, полициклические ароматические амины, нитрозамины, тяжелые металлы, пестициды. Действие металлов на наследственный аппарат клетки.
-
Тесты на растениях: анализ мутаций на генном уровне, цитогенетический анализ тканей растений, флуоресцентная in situ гибридизация, анафазный метод и микроядерный тест, алкалиновый метод комет, определение флуктуирующей асимметрии растений. Тесты на животных: выявление структурных и количественных аберраций хромосом, метод флуоресцентной гибридизации in situ, микроядерный тест, комета-тест, гель-электрофорезный тест, обнаружение аддуктов ДНК.
-
Микроорганизмы в качестве тест-систем: Salmonella typhimurium (тест Эймса), Saccharomyces cerevisae (альфа-тест). Растения в качестве тест-систем: особенности растительных организмов, позволяющие их использовать в качестве тест-систем; наиболее часто используемые в скрининге мутагенов растительные тест-системы; оценка качества окружающей среды с помощью традесканции (мутации в клетках тычиночных нитей, микроядерный тест). Животные в качестве тест-систем: дрозофила – объект для исследования мутагенности токсикантов (метод Меллер-5).
-
Понятие об экологической генетике. Основные направления генетического мониторинга природных популяций. Хлорелла – объект для проведения исследований динамики мутационного процесса в популяциях. Закономерности мутационного процесса в радиоактивно облучаемых популяциях. Реакция популяции на стресс.
-
Приготовление стоковых растворов мутагенов (бромистый этидий 50 мкг/мл; фурациллин 50 мкг/мл). Приготовление растворов мутагенов с меньшей концентрацией путем разведения стоковых растворов (бромистый этидий: 10 мкг/мл; 0,5 мкг/мл); (фурациллин: 20 мкг/мл; 5 мкг/мл; 1 мкг/мл). Стерилизация растворов мутагенов путем пропускания через бактериальные фильтры.
Посев индикаторных штаммов S. typhimurium (ТА100; ТА98) на LB-среду с последующей инкубацией при 37°С в течение суток.
Приготовление суспензий клеток S. typhimurium (ТА100; ТА98) в физиологическом растворе. Приготовление фракции S9.
Внесение исследуемых растворов мутагенов, микросомной активированной смеси, фракции S9 и суспензий индикаторных бактерий в полужидкий агар. Посев индикаторных штаммов, путем разливания полученной их смеси с мутагенами и микросомной активированной смесью, содержащей фракцию S9, на плотную среду.
Подсчет колоний ревертантов His+. Заполнение рабочих таблиц.
-
Посев двух родительских штаммов S. cerevisae в жидкую среду с последующей инкубацией при 30°С в течение суток.
Приготовление суспензий клеток S. cerevisae в физиологическом растворе. Высев суспензий клеток обоих штаммов S. cerevisae на плотную среду. Нанесение на среду в центре чашки диска фильтровальной бумаги с раствором испытуемого мутагена. Инкубация чашек при 30°С в течение суток.
Перепечатывание полученных колоний на селективную среду с последующей инкубацией при 30°С в течение 2-3 суток.
Учет результатов. Оформление протокола в рабочей тетради.
-
Методы изучения генетической структуры популяций. Исследование мутационного процесса в половых клетках человека и снижение генетического груза популяции. Оценка миграционных потоков аллелей. Оценка мутагенеза в соматических клетках человека.
-
Общий статус трансгенных культур в мире. Риски, связанные с интродукцией трансгенных растений в окружающую среду. Основные методы генетического мониторинга трансгенов.
-
Пробоподготовка и первый этап выделения ДНК: гомогенизация ломтиков сырого картофеля или вымоченных в дистиллированной воде семян кукурузы (сои) в фарфоровых ступках с лизирующим буфером при помощи пестика; инкубация суспензий в микропробирках при 65°С в течение 15 мин; фенольно-хлороформная депротеинизация; осаждение ДНК 96%-ным этиловым спиртом.
Второй этап выделения ДНК: переосаждение ДНК 70%-ным этиловым спиртом; лиофилизация ДНК с последующим растворением в ТЕ-буфере.
Подготовка реакционной смеси, настройка термоциклера и проведение амплификации.
Приготовление агарозного геля. Учет результатов ПЦР методом горизонтального электрофореза.
-
-
-
-
-
-