Ферменты и клиническая энзимология

1. Предисловие

Ферме́нты (от лат. fermentum — «закваска»), или энзи́мы[1] (от греч. ζύμη, ἔνζυμον «закваска»), — обычно сложные белковые соединения, РНК (рибозимы) или их комплексы, ускоряющие химические реакции в живых системах. Каждый фермент, свернутый в определённую структуру, ускоряет соответствующую химическую реакцию: реагенты в такой реакции называются субстратами, а получающиеся вещества — продуктами. Ферменты специфичны к субстратам: АТФ-аза катализирует расщепление только АТФ, а киназа фосфорилазы фосфорилирует только фосфорилазу

2. Номенклатура

Обычно ферменты именуют по типу катализируемой реакции, добавляя суффикс -аза к названию субстрата (например, лактаза — фермент, участвующий в превращении лактозы). Таким образом, у различных ферментов, выполняющих одну функцию, будет одинаковое название или один и тот же фермент имеет два и более названий. Такие ферменты различают по другим свойствам, например, по оптимальному pH (щелочная фосфатаза) или локализации в клетке (мембранная АТФаза). Многие ферменты имеют исторически сложившиеся тривиальные названия, не связанные с названиями их субстратов, например пепсин и трипсин. Из-за этих и других затруднений, а также вследствие всевозрастающего числа вновь открываемых ферментов было принято международное соглашение о создании систематической номенклатуры и классификации ферментов

3. Классификация

По типу катализируемых реакций ферменты подразделяются на 6 классов согласно иерархической классификации ферментов (КФ, EC — Enzyme Comission code). Классификация была предложена Международным союзом биохимии и молекулярной биологии (International Union of Biochemistry and Molecular Biology). Каждый класс содержит подклассы, так что фермент описывается совокупностью четырёх чисел, разделённых точками. Например, пепсин имеет название ЕС 3.4.23.1. Первое число грубо описывает механизм реакции, катализируемой ферментом:

КФ 1: Оксидоредуктазы, катализирующие перенос электронов, то есть окисление или восстановление. Пример: каталаза, алкогольдегидрогеназа.

КФ 2: Трансферазы, катализирующие перенос химических групп с одной молекулы субстрата на другую. Среди трансфераз особо выделяют киназы, переносящие фосфатную группу, как правило, с молекулы АТФ.

КФ 3: Гидролазы, катализирующие гидролиз химических связей. Пример: эстеразы, пепсин, трипсин, амилаза, липопротеинлипаза.

КФ 4: Лиазы, катализирующие разрыв химических связей без гидролиза с образованием двойной связи в одном из продуктов, а также обратные реакции.

КФ 5: Изомеразы, катализирующие структурные или геометрические изменения в молекуле субстрата с образованием изомерных форм.

КФ 6: Лигазы, катализирующие образование химических связей C—C, C—S, C—O и C—N между субстратами за счёт реакций конденсации, сопряжённых с гидролизом АТФ. Пример: лигаза

КФ 7: Транслоказы, катализирующие перенос ионов или молекул через мембраны или их разделение в мембранах.

Второе число в наименовании фермента отражает подкласс, третье — подподкласс, а четвёртая — порядковый номер фермента в его подподклассе.

Будучи катализаторами, все ферменты ускоряют как прямую, так и обратную реакции, поэтому, например, лиазы способны катализировать и обратную реакцию — присоединение по двойным связям.

4. Клиническая классификация

Клеточные ферменты в зависимости от локализации в тканях делят на две группы:

1)  неспецифические ферменты, которые катализируют общие для всех тканей реакции обмена и находятся в большинстве органов и тканей;

2)органоспецифические, или индикаторные, ферменты, специфичные только для опре­деленного типа тканей.

В сыворотке крови активность клеточных ферментов низка или вообще отсутствует. При патологических процессах активность ферментов этой группы в сыворотке крови зави¬сит от скорости высвобождения из клеток, которая в свою очередь определяется скоростью повреждения клеток, и от степени повреждения клетки.

Секреторные ферменты (церулоплазмин, псевдохолинэстераза, липопротеиновая липа­за) поступают непосредственно в плазму крови и выполняют в ней специфические функции. Эти ферменты синтезируются в печени и постоянно высвобождаются в плазму. Их актив­ность в сыворотке крови выше, чем в клетках или тканях. В клинической практике они представляют интерес, когда их активность в сыворотке крови становится ниже нормы за счет нарушения функции печени.

Экскреторные ферменты образуются органами пищеварительной системы (поджелу­дочной железой, слизистой оболочкой кишечника, печенью, эндотелием желчных путей). К ним относятся альфа-амилаза, липаза, щелочная фосфатаза и др. В норме их активность в сыворотке крови низка и постоянна. Однако при патологии, когда блокирован любой из обычных путей экскреции, активность этих ферментов в сыворотке крови значительно уве­личивается.

5. Изоферменты

Изоферменты, или изоэнзимы — это различные по аминокислотной последовательности изоформы или изотипы одного и того же фермента, существующие в одном организме, но, как правило, в разных его клетках, тканях или органах.

Изоферменты, как правило, высоко гомологичны по аминокислотной последовательности и/или подобны по пространственной конфигурации. Особенно консервативны в сохранении строения активные центры молекул изоферментов. Все изоферменты одного и того же фермента выполняют одну и ту же каталитическую функцию, но могут значительно различаться по степени каталитической активности, по особенностям регуляции или другим свойствам.

6. Ферментативная активность

Для количественной оценки активности ферментов Комиссия по ферментам Междуна¬родного биохимического союза рекомендовала стандартную международную единицу (ME). За единицу активности любого фермента принимают то его количество, которое в оптималь¬ных условиях катализирует превращение 1 мкмоль субстрата в 1 минуту (мкмоль/мин).

Об активности фермента судят по скорости катализируемой реакции при определенных температуре, рН среды, концентрации субстрата, поэтому при определении активности фер¬ментов необходимо строго соблюдать одни и те же условия.

Ферментативная реакция чувствительна к изменениям температуры. Обычно фермента¬тивную реакцию принято проводить при температуре, лежащей в пределах 25—40 °С, однако при разной температуре оптимальные значения рН, концентрации буфера, субстрата и дру¬гих параметров различны. Максимальная активность большинства ферментов в организме человека наблюдается при температуре около 37 °С. Поэтому в целях международной стан¬дартизации температуры измерения активности ферментов используется 37 °С [Marks D.B. et al., 1996]. Нормальные величины активности ферментов приведены ниже для 37 "С.

За международную единицу активности принимается количество фермента, способного превратить один микромоль (мкмоль) субстрата за 1 мин. в стандартных условиях. Международные единицы количества фермента отражаются символом Е (U). 1 Е (U) = 1 мкмоль/мин = 16,67 нмоль/с.

Удельная активность фермента равняется его массе (в миллиграммах), которая способна превратить 1 мкмоль субстрату за 1 мин в стандартных условиях, и выражается у мкмоль/(мин • мг) белка.

Рекомендуется также новая единица каталитической активности - катал (символ – кат.), что являет собой количество фермента, способное осуществить превращение 1 моля субстрата за 1 сек в стандартных условиях (кат = моль/с). Исходя из этого, 1 Е (1 U) = 16,67 нкат.

В пересчете на 1 л биологического материала активность фермента выражают в Е/л, (U/L), кат/л = моль/(с • л).

Если активность фермента выражена в мккат/л, а ее нужно выразить в Е/л (U/L), нужно воспользоваться формулой: Е/л (U/L) = мккат/л • 60сек .

Например, если активность щелочной фосфатазы 1,9 мккат/л, то в международных единицах она будет равняться 1,9 мккат/л*60 = 114 Е/л (U/L).

Если активность фермента выражена в Е/л (мкмоль/мин • л)), а ее нужно выразить в моль/час • л), нужно значение Е/л умножить на коэффициент 0,06.

7. Внутриклеточная локализация ферментов

В ядрышке ядра локализованы РНК-полимеразы - ферменты, которые катализируют образование и-РНК, р-РНК и т-РНК.

В ядре содержатся ферменты, которые принимают участие в процессе репликации ДНК, синтезе никотинамидадениндинуклеотида (НАД).

С митохондриями связанные ферменты пируватдегидрогеназного комплекса, цикла трикарбоновых кислот, окисляют жирные кислоты и некоторые аминокислоты, синтеза мочевины, а также ферменты переноса электронов и окислительного фосфорилирования.

В лизосомах содержатся преимущественно гидролитические ферменты с оптимумом рН в зоне 5. Именно через гидролитический характер действия ферментов эти органеллы назвали лизосомами.

В рибосомах локализуются ферменты белкового синтеза. В этих структурах происходит связывание аминокислот в полипептидные цепи с образованием молекул белка.

В эндоплазматическом ретикуллиуме локализованы ферменты синтеза липидов, а также ферменты, которые принимают участие в реакциях гидроксилирования.

С плазматической мембраной в первую очередь связанные АТФ-аза, что обеспечивает транспортировку ионов Na+ и К+, аденилатциклаза и ряд других ферментов.

В гиалоплазме (недифференцированной части внутриклеточного содержания) локализованные ферменты гликолиза, пентозного цикла окисления углеводов, синтеза жирных кислот, синтеза мононуклеотидов, активации аминокислот, а также много ферментов глюконеогенеза.

8. ПРИНЦИПЫ ЭНЗИМОДИАГНОСТИКИ

1. Состав ферментов и их тканевое деление постоянны и могут изменяться при разных патологических состояниях
   
2.  Для каждой ткани (органа) характерен свой качественный и количественный состав белков, что обусловливает функциональные особенности каждой ткани;
   

3.         Метаболические пути в разных тканях очень похожие, потому существует немного тканьспецифичных ферментов (например, кислая фосфатаза предстательной железы, орнитинкарбамоилтрансфераза и гистидаза печени);

4.         Более специфическим для тканей является соотношение разных ферментов и изоферментов.

Энзимодиагностика заключается в постановке диагноза заболевания (или синдрома) на основе определения активности ферментов в биологических жидкостях человека. Принципы энзимодиагностики основаны на следующих позициях:

• при повреждении клеток в крови или других биологических жидкостях (например, в моче) увеличивается концентрация внутриклеточных ферментов повреждённых клеток;
• количество высвобождаемого фермента достаточно для его обнаружения;
• активность ферментов в биологических жидкостях, обнаруживаемых при повреждении клеток, стабильна в течение достаточно длительного времени И отличается от нормальных значений;
• ряд ферментов имеет преимущественную или абсолютную локализацию в определённых органах (органоспецифичность);
• существуют различия во внутриклеточной локализации ряда ферментов.

9. Причины, приводящие к увеличению количества ферментов в крови

Ферменты плазмы крови можно разделить на 2 группы. Первая, относительно небольшая группа ферментов активно секретируется в плазму крови определёнными органами. Например, печень синтезирует неактивные предшественники ферментов свёртывающей системы крови. Ко второй относят большую группу ферментов, высвобождающихся из клеток во время их нормального функционирования. Обычно эти ферменты выполняют свою функцию внутри клетки и не имеют физиологического значения в плазме крови. У здорового человека активность этих ферментов в плазме низкая и достаточно постоянная, так как постоянно соотношение скоростей высвобождения их из клеток и скоростей разрушения.

При многих заболеваниях происходит повреждение клеток, и их содержимое, в том числе и ферменты, высвобождаются в кровь. К причинам, вызывающим высвобождение внутриклеточного содержимого в кровь, относят нарушение проницаемости мембраны клеток (при воспалительных процессах) или нарушение целостности клеток (при некрозе). Определение в крови активности ряда ферментов хорошо налажено в биохимических лабораториях, что используют для диагностики заболеваний сердца, печени, скелетной мускулатуры и других тканей. Уровень активности ферментов в плазме коррелирует со степенью повреждения клеток.

Для энзимодиагностики имеют большое значение знания о субклеточной локализации ферментов. Так, появление в плазме крови ферментов, имеющих только цитозольную локализацию, свидетельствует о воспалительном процессе; при обнаружении митохондриальных или ядерных ферментов можно говорить о более глубоких повреждениях клетки, например о некрозе.

Однако повышение концентрации ферментов не всегда связано с повреждением тканей. При избыточной клеточной пролиферации, например при онкопролиферативных процессах, при повышенной скорости синтеза некоторых ферментов в клетках или при нарушенном клиренсе (способности вьпюдиться почками) наблюдают повышение концентрации в крови определённых ферментов. Врачам следует учитывать, что нормальные значения активности ферментов в крови детей и беременных женщин отличаются от показателей, характерных для взрослых здоровых людей.

10. Основные ферменты, которые исследуются в лабораториях

 аспартатаминотрансфераза (AcAT)

аланинаминотрансфераза (АЛАТ)

глутаматдегидрогеназа (ГЛД)

лактатдегидрогеназа (ЛДГ)

креатинкиназа (КК)

щелочная фосфатаза (ЛФ)

кислая фосфатаза (КФ)

альдолаза (АЛД)

холинестераза (ХЕ)

ά-амилаза (AM)

липаза (ЛП)

аланинаминопептидаза (ААП)

глюкозо-6-фосфатаза

γ-глутамилтрансфераза (ГЛТ)

аргиназа (Ар)

сорбитолдегидрогеназа (СД)

алкогольдегидрогеназа (АДГ)