Дисциплина Медицинская биохимия, принципы измерительных технологий в биохимии, патохимия, диагностика, биохимия злокачественного роста Часть 1

Спектроскопия – физический метод исследования закономерностей взаимодействия электромагнитного излучения (света) с химическим веществом. Такие взаимодействия могут сопровождаться поглощением, излучением или рассеянием электромагнитного излучения.

Взаимодействие электромагнитного колебания с химическим веществом приводит к возбуждению переходов между энергетическими уровнями вещества (атома или молекулы).

Спектроскопия позволяет получать сведения об энергетических стационарных состояниях атомов или молекул на основании переходов между этими состояниями.

Виды спектроскопии

1. Атомная изучает энергетические переходы между электронными орбиталями атомов.

2. Молекулярная  изучает энергетические переходы между электронными, колебательными, вращательными уровнями энергии молекул.

 

Методы атомной спектроскопии:

- Атомно-абсорбционная спектроскопия

- Атомно-эмисионная спектроскопия

- Атомная флуоресценция

 

Методы молекулярной спектроскопии:

- Электронная спектроскопия.

- Инфракрасная спектроскопия.

- Спектроскопия комбинационного рассеяния света.

- Микроволновая спектроскопия.

- Ядерный магнитный резонанс.

- Электронный парамагнитный резонанс.

- Масс-спектрометрия.

Абсорбционная спектроскопия используется для изучения биомолекул во всем диапазоне электромагнитного спектра.

Рис. Спектр электромагнитного излучения

Характеристики электромагнитного излучения:

- длина волны λ -расстояние между двумя ближайшими друг к другу точками в пространстве, в которых колебания происходят в одинаковой фазе

- волновое число k - величина, обратная длине волны (1/λ), единицы измерения (см⁻¹)

- частота v - количество полных колебаний в единицу времени

зависимость между энергией Е электромагнитного излуче­ния и частотой ν установил физик Макс Планк

Е = h·v                                  

Где, Е –энергия электромагнитного излучения, Дж, h- 6,6256 ·10^-34   Дж·с, постоянная Планка (квант действия Планка), v- частота электромагнитного излучения, Гц.

Для измерения абсорбции излучения в зависимости от длины волны падающего света в настоящее время обычно применяют двухлучевые спектрофотометры. Из испускаемого полихроматического излучения (непрерывного спектра в широком диапазоне длин волн) с помощью монохроматора выделяют излучение только с определенной длиной волны λ (монохроматическое излучение) и интенсивностью I₀, после чего специальными приспособлениями направляют его на образец.

Образец при этом помещают в маленькую емкость, кювету. В этом растворе излучение частично поглощается, а интенсивность излучения I, прошедшего через раствор, регистрируется детектором. На регистрирующее устройство передается значение величины оптической плотности, которое по закону Ламберта — Бера пропорционально концентрации аналита.

   

Закон Бугера-Ламберта-Бера

1729 г. - Экспериментально открыт П. Бугером

1760 г. - Теоретически выведен И.Г. Ламбертом

1852 г. - Исследован для расстворов А. Бером

 

а – коэффициент светопоглощения, зависит от длины волны, но не зависит от концентрации

ε – молярный коэффициент поглощения

l – толщина поглощающего слоя, см

с – концентрация

Если концентрация С выражена  в молях на литр,

l – в см, то  а представляет собой молярный коэффициент светопоглощения и обозначается  ε

А – погашение (оптическая плотность  D)

T – пропускание

Закон справедлив только для:

- прозрачных растворов (помутнения, могут рассеивать свет, вызывая искажение результатов)

- разбавленных растворов (слишком концентрированные растворы поглощают излучение очень интенсивно)

- используется монохроматичное излучение (излучения с одинаковой длиной волны), так как коэффициент экстинкции ε, зависит от длины волны λ.