Медицинская биохимия (10 семестр)
Методы определения содержания триглицеридов
Наиболее предпочтительными являются ферментные методы исследования содержания ТГ с учетом содержания в холостой пробе свободного глицерина.
Метод определения содержания триглицеридов в сыворотке крови с ацетилацетоном
Принцип метода
Триглицериды экстрагируются из сыворотки крови. Освобожденный в результате щелочного гидролиза глицерин окисляют до формальдегида с помощью метаперйодата натрия. Образовавшийся формальдегид образует с ацетилацетоном в слабом уксусном растворе 3,5-диацетил-1,4-дигидролютидин, интенсивность окраски которого пропорциональна содержанию триглицеридов.
Необходимые реактивы
1. Гептан.
2. Изопропиловый спирт (изопропанол).
3. 0,08 н серная кислота (примерно 2,2 мл концентрированной H2SO4 на 1 л воды).
4. Едкое кали, 6,25 моль/л: 17,8 г KON растворяют в 50 мл, осторожно добавляя гранулы щелочи в воду, охлаждая и перемешивая.
5. Уксусная кислота, 50 г/л.
6. Йодная кислота: растворяют 0,6 г HIO4 ∙ 2H2O (перйодная кислота) в 100 мл 5%-ной уксусной кислоты.
7. Аммония ацетат, 2 моль/л: растворяют 154 г ацетата аммония в воде, объем доводят до 1 л.
8. Ацетилацетоновый реактив: 1,5 мл ацетилацетона (СН3СОСН2СОСН3) разводят раствором уксуснокислого аммония до суммарного объема 200 мл. Хранят в сосуде из темного стекла.
9. Калибровочный раствор триолеина, 2 ммоль/л. Содержит 170 мг триолеина в 100 мл изопропилового спирта. Можно использовать и другие калибровочные растворы, перечисленные в примечании.
Примечание
Если использовать для калибровки раствор триолеина в изопропиловом спирте, то после экстракции и расслоения объем верхней фазы в калибровочных пробах оказывается больше, чем в опытных, что приводит к заниженным результатам анализа.
Чтобы избежать этой ошибки, рекомендуют калибровочный раствор готовить по следующей прописи: 510 мг триолеина растворить в 100 мл изопропилового спирта, из полученного исходного калибровочного раствора с содержанием 6 ммоль/л готовить по мере необходимости рабочий калибровочный раствор с содержанием 1,2 ммоль/л, разводя 1 объем исходного калибровочного раствора 4 объемами воды.
Ход определения
К 0,5 мл сыворотки или плазмы добавляют 2 мл гептана, 3,5 мл изопропилового спирта и 1 мл 0,08 н серной кислоты, перемешивают и через 5 мин центрифугируют. Из верхнего (гептанового) слоя отбирают 0,4 мл, добавляют 2 мл изопропилового спирта и 1 каплю 6,25 н KOH. Перемешивают, закрывают пробкой и нагревают на водяной бане в течение 10 мин при температуре 70 °С. После охлаждения добавляют 0,2 мл перйодатного реактива и 1 мл ацетилацетонового реактива, после перемешивания снова закрывают пробкой и нагревают еще 10 мин при 70 °С. Развивается желто-зеленое окрашивание, интенсивность которого измеряют, фотометрируя при длине волны 425 нм в кюветах с длиной оптического пути 0,5 см против холостой пробы, которую ставят так же, как и опытную, но вместо исследуемого материала берут 0,5 мл воды.
Калибровочную пробу ставят так же, как и опытную, но вместо сыворотки или плазмы берут 0,5 мл калибровочного раствора и 0,5 мл воды; развивающаяся окраска соответствует окраске опытной пробы, в которую взята плазма с содержанием триглицеридов 2 ммоль/л.
Расчет проводят по правилу пропорций или по калибровочному графику. Если используется калибровочный раствор, уже содержащий воду, то при постановке калибровочного опыта берут 0,5 мл рабочего калибровочного раствора, а воду не добавляют.
Примечание
При отсутствии триолеина или трибутирина для калибровки можно использовать растительное масло, принимая, что образующие его триглицериды имеют ту же молекулярную массу, что и триолеин. Можно проводить калибровку, используя раствор глицерина в этаноле, в этом случае его непосредственно добавляют к щелочному раствору едкого калия.
Метод определения содержания триглицеридов в сыворотке крови с хромотроповой кислотой
Принцип метода
Триглицериды гидролизуются с освобождением глицерина, который окисляется перйодатом натрия до формальдегида. Образующиеся при этом йодаты и непрореагировавшие перйодаты восстанавливаются избытком бисульфита натрия, после чего формальдегид определяют по цветной реакции с хромотроповой кислотой.
Ферментативный метод определения содержания триглицеридов в сыворотке крови
Принцип метода
Триглицериды ферментативно гидролизуются до глицерола в соответствии со следующей схемой реакции:
Триглицериды ↔ глицерол + жирные кислоты;
Глицерол + АТФ ↔ глицерол-3-Ф + АДФ;
Глицерол-3-Ф + О2 ↔ фосфоглицероальдегид + Н2О2;
Н2О2 + 4-аминоантипирин + n-хлорфенол ↔ Н2О2 + хинонимин.
Образующаяся в ходе ферментативной реакции окраска пропорциональна содержанию ТГ. Референтные пределы для ТГ, установленные Национальной программой по холестерину (США), широки. Рекомендованы пороговые уровни для оценки триглицеридемии — норма: 0,45—2,83 ммоль/л (44,9—282,7 мг/дл); пограничные величины: 2,82—5,65 ммоль/л; гипертриглицеридемия: выше 5,65 ммоль/л; высокий риск панкреатита: выше 11,3 ммоль/л.
Клинико-диагностическое значение
Увеличение концентрации ТГ (гипертриглицеридемия) наблюдается при эссенциальной гиперлипемии и при первичной (семейной) гиперлипопротеидемии. Считают, что определение ТГ является одним из решающих показателей для диагностики отдельных типов врожденного нарушения обмена липидов.
К вторичному повышению концентрации триглицеридов приводят ожирение, нарушение толерантности к глюкозе, эрозивные или плоскоклеточные ксантомы, вирусный гепатит, алкоголизм, алкогольный цирроз, билиарный цирроз, внепеченочная обтурация желчных путей, острый и хронический панкреатит, нефротический синдром, хроническая почечная недостаточность, гипертоническая болезнь, острый инфаркт миокарда, хроническая ИБС, тромбоз сосудов мозга, гипотиреоз, сахарный диабет, подагра, беременность, гликогенозы I, III, IV типов, большая талассемия, синдром Дауна, респираторный дистресс-синдром, невротическая анорексия, идиопатическая гиперкальциемия, острая перемежающаяся порфирия, стресс.
Снижение ТГ наблюдается при а-β-липопротеидемии, гиполипопротеидемии, хронических обструктивных заболеваниях легких, инфаркте мозга, гипертиреозе, гиперпаратиреозе, недостаточности питания, синдроме мальабсорбции, лимфангиоэктазии кишечника, поражении паренхимы печени.
Последнее изменение: Пятница, 15 Декабрь 2017, 16:56