Жидкостная экстракция (ЖЖЭ) – традиционный тип пробоподготовки,
который отличается селективностью извлечения, несложной реализацией и
невысокой стоимостью.
Чаще всего при разработке биоаналитической методики применяют
наиболее простой – распределительный вариант жидкостно-жидкостной
экстракции. Для этого к биологическому образцу, доведенному до
необходимого значения pH, добавляют органический растворитель. После
перемешивания органический слой отделяют, удаляют растворитель
выпариванием и производят растворение в подходящем для анализа растворе.
Следует отметить, что важную роль при выборе экстрагента играют химические
свойства аналита. Существует простой способ управления полярностью аналитов-
кислот и аналитов-оснований с помощью рН. Ионизованные формы являются
гораздо гидрофильнее их нейтральных аналогов. Вследствие этого следует
ожидать большее сродство к органической фазе (высокое значение KD) в случае,
когда аналит находится в нейтральном состоянии, и, соответственно, – слабое
(низкое значение KD), когда молекула аналита полностью ионизована (Рис.17).
Рис.17. Зависимость коэффициента распределения от значения рН среды
При этом имеется и промежуточный диапазон, в котором сродство к той
или иной фазе варьируется с изменением рН для частично ионизованных форм
аналита. Описываемая кривая аналогична кривой титрования. Точка перегиба
такой кривой находится при значении рН, при котором степень диссоциации
составляет 50% - рКа. Кривые зависимостей «коэффициент распределения - рН»
для кислот и оснований качественно являются зеркальными отображениями друг
друга. В случае кислот следует ожидать увеличения сродства аналита к
органической фазе при низких значения рН, а для оснований – при высоких.
Наиболее распространенными экстрагентами являются
трет.бутилметиловый эфир, этилацетат, их смеси с
дихлорметаном или гексаном]. Для переведения определяемого
вещества в форму, необходимую для лучшего извлечения, используют различные
подходы. Чтобы получить более щелочную среду применяют растворы
гидроксида натрия или аммония. Для подкисления плазмы
до необходимого значения рН используют соляную либо муравьиную
кислоту. Широкое применение для этих целей нашли буферы: ацетатно-
аммонийный, фосфатный. Считается, что именно буферы помогают нивелировать различие в кислотности плазмы крови различных доноров, что
улучшает воспроизводимость при последующем анализе.
При всех преимуществах жидкостно-жидкостной экстракции у нее есть и
ряд недостатков. К основным можно отнести трудоемкость, времязатратность и
довольно большое количество манипуляций с образцом.
Тем не менее, эта процедура гораздо более селективна в сравнении с
осаждением белков и позволяет достигать высоких степеней извлечения.
Жидкость-жидкостная экстракция
Эффективным и распространенным методом в химико-токсикологическом анализе является жидкость-жидкостная экстракция. Этот метод применяется при извлечении ее- ществ из крови, лимфы, слюны, перитонеальной жидкости, мочи и промывных вод желудка. Он также используется на втором этапе при изолировании ядовитых соединений из трупного материала.
Жидкость-жидкостная экстракция — это метод выделения, разделения и концентрирования веществ, основанный на распределении растворенного вещества между двумя жидкими несмешивающимися фазами. В токсикологической химии чаще всего одной жидкой фазой является вода, другой — органический растворитель. Органический растворитель должен обладать высокой растворяющей способностью для анализируемого вещества, иметь низкую температуру кипения. Однако выбор органических растворителей невелик. Наиболее часто для этой цели используют диэтиловый эфир и хлороформ. Выбор органического растворителя определяется свойствами анализируемого соединения.
В условиях равновесия отношение концентраций вещества в обеих фазах представляется константой распределения (К), которая не зависит от общей концентрации вещества.
К = [Со] / [Св]
где Со и Св — равновесные концентрации вещества в обеих фазах (органической, водной) в одной и той же форме.
Однако при экстракции могут происходить различные процессы: ассоциация, диссоциация, сольватация, комплексообразование. Практическое значение при химикотоксикологическом анализе имеет отношение общих (аналитических) концентраций экстрагируемого вещества, которое называют коэффициентом распределения (D).
D = Со / Св
где Со и Св — общие концентрации вещества в органической и водной фазе (независимо от формы существования вещества).
Коэффициент распределения определяют экспериментально в реальных условиях. Его значение используют для разработки условий экстракции ядовитого вещества.
Степень извлечения (процент экстракции) при однократной экстракции рассчитывают по формуле:
R = (100 · D) / (D+Vв/Vо)
где R — степень экстракции, %, D — коэффициент распределения, Vв и Vо — равновесные объемы водной и органической фаз.
Эта формула позволяет рассчитать объем органической фазы для определенного процента извлечения вещества при однократной экстракции.
Пример. Найти объем органического растворителя для извлечения 99% вещества из 100 мл водного раствора при однократной экстракции. Коэффициент распределения равен 20.
Из предыдущей формулы находим:
Vо = (R · Vв) / ( (100-99) · 20)
Подставляя указанные значения R и D, находим:
Vо = (99 · 100) / ( (100-99) · 20) = 495 мл
При многократной экстракции удается добиться полной экстракции значительно меньшим объемом органического растворителя. В этом случае расчет степени экстракции проводится по формуле:
R = 100 · [1- (Vв/ (D·Vo+Vв))n]
где п — кратность экстракции.
Для приведенного выше примера при D=20, объеме водной фазы 100 мл достаточно использовать трехкратное извлечение органическим растворителем объемом 25 мл.
R = 100 · [1- (100/ (20·25+100))3]
Таким образом, данным количеством растворителя можно полнее извлечь растворенное вещество, если проводить экстракцию многократно малыми порциями растворителя.
По приведенной выше формуле можно найти необходимую кратность экстракции при заданных условиях с целью достижения требуемой степени экстракции. Из вышеприведенных формул можно найти:
n = [lg (1- (R/100))] / [lg (Vв/ (D·Vo+Vв)]
Используя данные взятого примера VB=100 мл; V0=25 мл; D=20, найдем число экстракций для извлечения 99% вещества:
n = [lg (1- (99/100))] / [lg (100/ (500+100)] = -2 / -0,778 = 2,57 (округлено 3)
Добавление электролитов в водную вытяжку оказывает высаливающее действие за счет понижения растворимости ядовитых веществ в воде. В результате повышается степень их экстракции органическим растворителем.