Дисциплина Медицинская биохимия (часть 1_осенний семестр)

Опыт № 1: Количественное определение общего белка сыворотки крови рефрактометрическим методом.

Принцип метода. Метод основан на изменении коэффициента рефракции (преломления) раствора в зависимости от концентрации растворенного в нем вещества.

Техника выполнения. На промытую дистиллированной водой и насухо протертую марлевой салфеткой призму рефрактометра наносят каплю дистиллированной воды для проверки нулевой точки прибора. Закрыв камеру, добиваются хорошей освещенности поля зрения рефрактометра при помощи зеркала. Пользуясь рычагом прибора, совмещают границу светотени с точкой перекреста двух линий. Снимают отсчет показателя преломления. Для воды он равен 1,333. Удалив воду, на призму наносят каплю исследуемой сыворотки. Определив ее коэффициент преломления, по таблице находят содержание белка в г/л.

Опыт № 2: Количественное определение общего белка сыворотки крови биуретовым методом.

Принцип метода. Метод основан на способности белка давать с раствором CuSO₄ в щелочной среде фиолетовое окрашивание за счет пептидных связей, интенсивность которого пропорциональна концентрации белка (количеству пептидных групп).

Техника выполнения. В пробирки вносят реактивы по следующей схеме:

Содержимое пробирок тщательно перемешивают, избегая образования пены, выдерживают при комнатной температуре (18-25 ⁰С) в течение 30 минут и определяют оптическую плотность при длине волны 540 нм (500-560 нм, зеленый светофильтр) в кювете с толщиной слоя 1 см против холостой пробы. Окраска стабильна в течение 1 часа. Расчет содержания белка производят по формуле:

С = Аоп/Аэт ´ 60,

 где          С – содержание белка в опытной пробе, г/л;

                A_оп – оптическая плотность опытной пробы;

                A_эт – оптическая плотность эталона;

                60 – содержание белка в калибровочном растворе, г/л.

Опыт № 3: Электрофорез белков сыворотки крови на бумаге и в полиакриламидном геле (демонстрация).

Электрофорез—это движение заряженных частиц в растворе под влиянием внешнего электрического поля. Существует несколько разновидностей электрофоретического метода разделения белков:

–        электрофорез в жидкой среде;

–        электрофорез в блоках (крахмальном, агарозном, полиакриламидном);

–        электрофорез на бумаге.

Наибольшей разрешающей способностью, под которой понимают число выявленных в анализируемом материале белковых фракций, отличается электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ). Полиакриламидный гель пористый, обладает значительной механической прочностью, однороден по составу, химически инертен. Он дает возможность исследовать белковые растворы разных концентраций в небольших объемах (0,001 мл) и проводить быстрое разделение (в течение 60–70 мин.). Электрофорез в ПААГ сочетает 2 принципа разделения: по электрофоретической подвижности и на основе эффекта молекулярных «сит», т.е. частицы разделяются не только по своим зарядам, но и «просеиваются» через гель в зависимости от размеров молекулы. Электрофорез белков сыворотки крови в ПААГ позволяет выделить в среднем от 10 до 25 фракций, в то время как электрофорез сыворотки крови на бумаге дает только 5 фракций (альбумины, α₁-, α₂-, β- и γ-глобулины).

Необходимо нарисовать схему прибора для электрофореза в ПААГ, и кривую, записанную с этой электрофореграммы денситометром.