Дисциплина Общая биохимия (часть 1_5 семестр)

Практическая работа

Опыт № 1: Определение концентрации общего холестерина в сыворотке крови ферментативным колориметрическим методом.

В плазме крови холестерол находится главным образом в составе ЛПНП и ЛПОНП, причём 60–70 % его представлено в форме сложных эфиров, а 30–40 % – свободного, НЭХС. Свободный и ЭХС составляют фракцию общего ХС.

С возрастом уровень ХС в плазме крови увеличивается. Так, у ребенка в возрасте 1 года содержание ХС в плазме крови равно 50 ± 10 мг/дл, а у взрослого 200 ± 40 мг /дл, или 5,2 ± 1,3 ммоль/л. Идеальное содержание ХС в сыворотке крови < 5,2 ммоль/л.

Повышение уровня ХС в сыворотке крови – гиперхолестеринемия или гиперхолестеролемия бывает первичной (например, при семейной гиперхолестеролемии) или вторичной при сахарном диабете, липоидном нефрозе, обтурационной желтухе и др. заболеваниях.

Принцип метода. При гидролизе эфиров холестерина ферментом холестеролэстеразой (ХЭ) образуется свободный холестерин. Образовавшийся и имеющийся в пробе холестерин окисляется кислородом воздуха под действием холестеролоксидазы (ХО) с образованием эквимолярного количества перекиси водорода. Под действием пероксидазы (ПО) перекись водорода окисляет хромогенные субстраты с образованием окрашенного продукта. Интенсивность окраски пропорциональна концентрации холестерина в пробе.

Эфиры холестерина + Н₂О  холестерин + жирные кислоты

Холестерин + О₂  4-холестенон + Н₂О₂

2Н₂О₂ + хромогенный субстрат  окрашенный продукт + 2 Н₂О

Реактивы: (1) Реагент – лиофилизованные ферменты + хромогены в фосфатном буфере; (2) Стандартный раствор холестерина с концентрацией 5,17 мМ (200 мг/100 мл).

Техника выполнения.

Реакционную смесь тщательно перемешивают, инкубируют не менее 5 мин при комнатной температуре и измеряют на ФЭКе оптическую плотность опытной и калибровочной проб против контрольной пробы в кюветах толщиной 0,5 см при длине волны 490 нм. Окраска стабильна не менее 2 часов после окончания инкубации при предохранении от прямого солнечного света. Результаты рассчитывают по формуле:

С_оп  = А_оп /А_эт  ´ 5,17 (мМ) или С_оп  = А_оп/А_эт  ´ 200 (мг / 100 мл)

Опыт № 2: Обнаружение кетоновых тел в моче.

К компонентам мочи, которые у здорового человека не обнаруживаются обычными качественными реакциями и считаются патологическими, относят такие вещества как белок, сахар, кетоновые тела, желчные пигменты, желчные кислоты, кровь. Кетоновые тела появляются в моче при нарушениях углеводного и липидного обменов, в частности при сахарном диабете и голодании.

(1) Реакция на ацетон с йодом (проба Либена). При взаимодействии ацетона с йодом в щелочной среде образуется йодоформ, присутствие которого узнается по появлению желтого осадка и характерному запаху.

К 5 каплям исследуемой мочи добавляют 1 каплю 10% раствора гидроксида натрия и 2–3 капли раствора Люголя. При наличии ацетона выделяется желтый осадок и появляется запах йодоформа.

(2) Реакция на ацетон и ацетоуксусную кислоту с нитропруссидом натрия (проба Легаля). Ацетон и ацетоуксусная кислота в щелочной среде образуют с нитропруссидом натрия оранжево-красное окрашивание, которое при подкислении уксусной кислотой  становится вишнево-красным.

К 5 каплям мочи добавляют 1 каплю 10% раствора нитропруссида натрия и 2 капли 10% раствора гидроксида натрия, появляется оранжево-красное окрашивание. При подкислении концентрированной уксусной кислотой оно становится вишнево-красным.

(3) Реакция на ацетоуксусную кислоту с хлорным железом (проба Герхардта). Энольная форма ацетоуксусной кислоты, взаимодействуя с хлорным железом, образует комплексное соединение вишнево-красного цвета.

К 5 каплям мочи прибавляют по каплям раствор 1% хлорного железа, появляется вишнево-красное окрашивание.

(4) Экспресс-анализ кетоновых тел в моче с помощью диагностических (тест) полосок. Принцип анализа основан на появлении фиолетового окрашивания в процессе взаимодействия кетоновых тел с нитропруссидом натрия (реакция Легаля).

Диагностические полоски кетофан (для обнаружения кетоновых тел в моче) или диафан (для исследования мочи на глюкозу и кетоны) опускают на 1–2 секунды в исследуемую мочу так, чтобы зоны индикации были смочены. Избыток мочи снимают с полоски, соприкасаясь со стенкой сосуда. Полоски оставляют в горизонтальном положении. Через 60 секунд сопоставляют окраску зон индикации с соответствующей цветной шкалой.