Дисциплина Медицинская биохимия. Принципы измерительных технологий в биохимии. Патохимия, диагностика. Биохимия злокачественного роста». Часть 3

COVID-19 начался как вспышка вирусной пневмонии от неизвестного происхождения в городе Ухань, столице провинции Хубэй в Китае. К 7 января 2020 года китайские ученые выделили новый штамм коронавируса, тяжелого острого респираторного синдрома коронавируса 2 (SARS-CoV-2) в качестве возбудителя этих пациентов с вирусной пневмонией. Здесь я хочу начать с обзора структуры этого вируса, как вирус получает проникновение и пять потенциальных терапевтических вмешательств: хлорохин, ремдесивир, ингибиторы протеазы TMPRSS2, ингибиторы IL-6 (сарилумаб / тоцилизумаб) и рекомбинантный ACE2. Я сделаю все возможное, чтобы эта статья обновлялась по мере поступления дополнительной информации. Ниже приводится сравнение COVID-19 с другими членами семейства коронавирусов по @VirusesImmunity.

Структура и вирусный геном
SARS-CoV-2 представляет собой 30-килобайтный РНК-вирус с позитивной цепью. Чтобы лучше оценить целевую терапию, нам необходимо сначала понять структуру SARS-CoV-2 и то, как вирус проникает в клетки-мишени. Новый коронавирус высоко гомологичен коронавирусу у летучих мышей и имеет значительную гомологию с SARS-CoV (филогения показана ниже). Основные структурные белки включают в себя: белок шипа (S), белок оболочки (E), мембранный белок (M) и нуклеокапсидный фосфопротеин. Кроме того, соответствующие транскрибируемые неструктурные белки включают: orf1ab, ORF3a, ORF6, ORF7a, ORF10 и ORF8. Следует отметить, что белки spike (S), ORF8 и ORF3a в SARS-CoV-2 значительно отличаются от других известных SARS-подобных коронавирусов. Эти различия могут привести к более серьезной вирулентности и передаче заболевания, чем исходный SARS-CoV. В частности, ORF8 быстро мутирует между множеством возникающих штаммов в разных странах 1.

Основными клеточными мишенями человека для коронавируса являются пневмоциты и энтероциты типа II. Так как же вирус попадает в клетки человека? Чтобы лучше понять это, нам нужно рассмотреть ангиотензинпревращающий фермент 2 (АСЕ2), гомолог АПФ. ACE2 представляет собой интегральный мембранный гликопротеин типа 1 и наиболее активно экспрессируется в почках, эндотелии, легких и в сердце. Основным субстратом для ACE2 является Ang II. ACE расщепляет ангиотензин I с образованием ангиотензина II, тогда как ACE2 инактивирует ангиотензин II (Ang II) и является негативным регулятором ренин-ангиотензиновой системы (RAS). Более конкретно, ACE2 разлагает Ang II, главный эффектор RAS, до вазодилататоров Ang 1-7 (таким образом уменьшая вазоконстрикцию). Кроме того, в отличие от ACE, который представляет собой дипептидазу, ACE2 функционирует как карбоксипептидаза, и, следовательно, активность ACE2 не антагонизируется обычными ингибиторами ACE.

ACE2 имеет отношение к нашему обсуждению, поскольку белок коронавируса S (шип) использует ACE2 в качестве рецептора для входа в клетку-хозяина. Белок S связывает каталитический домен ACE2 с высокой аффинностью, и этот домен высоко консервативен между SARS-CoV и SARS-Cov-2. Связывание белка коронавируса S с ACE2 запускает конформационное изменение белка S коронавируса, что позволяет протеолитическому расщеплению протеазами клеток-хозяев (TMPRSS2). Это взаимодействие клетки-хозяина TMPRSS2 и вирусной оболочки является потенциальной терапевтической мишенью, и мы вернемся к ней позже.

Несмотря на то, что ACE2 считается основным рецептором, служащим порталом входа, структурный анализ белка spike (S) показывает, что белок S слабо связывается с рецептором ACE2 по сравнению с исходным SARS-CoV. Cui и др. Отмечают, что ACE2 недостаточно экспрессируется в легком, главном органе-мишени для вируса 2. В их работе представлены ранние вычислительные данные для рецептора ангиотензина II типа 2 (AGTR2) в качестве потенциального вторичного рецептора, необходимого для SARS-CoV- 2 входа в клетки человека. AGTR2 представляет собой рецептор, связанный с G-белком, который может взаимодействовать с ACE2 и плотно экспрессируется в легких с высокой тканевой специфичностью. Структурное моделирование трехмерного белково-белкового взаимодействия показывает, что AGTR2 проявляет более высокую аффинность связывания с белком S 2019-nCov, чем ACE2. Следует отметить, что дальнейшее подтверждение молекулярными экспериментами необходимо для подтверждения этих вычислительных требований. Даже при ранних данных ACE2 по-прежнему считается основным рецептором проникновения вируса.

Методы лечения

Хлорохин. В клинических отчетах о синдроме COVID-19 у пациентов из Ухани описываются лабораторные отклонения со сниженным уровнем гемоглобина в присутствии высоких запасов железа (определяется ферритином и продукцией реагентов острой фазы). Одна теория, объясняющая лабораторные отклонения, состоит в том, что вирус разрушает порфирино-железный комплекс в молекуле гема. Недавняя работа Liu et al., Посвященная исследованиям докинга белков и моделированию гомологии, обеспечивает большую достоверность этой теории. Моделирование сворачивания белка показывает, что неструктурные белки ORF10, orf1ab и ORF3a атакуют молекулу гема и отделяют ее от атома железа с образованием порфирина. ORF6 и ORF7a переносят порфирин в ORF8; И ORF8 вместе с поверхностными гликопротеинами образует стабильный комплекс с порфирином, что в конечном итоге нарушает нормальную выработку эритроцитов. Из этих вычислительных экспериментов сравнивались энергии связывания orf1ab, ORF7a, ORF8 и порфирина, и было показано, что связывание ORF8 с порфирином является наиболее стабильным. Дальнейший анализ в том же исследовании показал, что хлорохин может предотвращать нападение orf1ab, ORF3a и ORF10 на молекулу гема и образование порфирина, а также ингибировать связывание поверхностных гликопротеинов ORF8 + с порфиринами. Эти результаты указывают на то, что хлорохин является потенциальным агентом для снижения вирусной нагрузки.

Ремдесивир: Ремдесивир (RDV) является экспериментальным пролекарством; Аналог 1'-цианозамещенного аденозинового нуклеотида с противовирусной активностью широкого спектра действия против одноцепочечных РНК-вирусов, включая SARS-CoV и MERS. Первоначально разработанный для лечения вируса Эбола, RDV демонстрирует некоторые перспективы в лечении COVID-19. Давайте посмотрим на механизм действия. По существу, RDV является нуклеотидным аналогом ингибитора РНК-зависимых РНК-полимераз (RdRps) 3. Одно предварительное исследование предполагает, что внутривенное введение дозы RDV 10 мг / кг (на моделях на животных) может привести к постоянным уровням его активной формы в крови , Трифосфатная форма RDV (RDV-TP) конкурирует с его естественным аналогом АТФ. Основываясь на исследованиях по молекулярной стыковке, кажется, что RDV-TP включается виронами более эффективно, чем АТФ. После включения в положение i ингибитор вызывал остановку синтеза РНК в положении i + 3. Следовательно, вероятным механизмом действия является задержка терминации РНК-цепи. Три дополнительных нуклеотида могут защищать RDV-TP от иссечения вирусной 3'-5'-экзонуклеазной активностью.

Ингибитор TMPRSS2: SARS-CoV-2 использует рецептор ACE2 для проникновения вируса, а белок spike (S) примирован клеточной сериновой протеазой TMPRSS2. Это взаимодействие может быть заблокировано ингибитором протеазы TMPRSS2. Мы можем разбить вирусную запись примерно на три шага:

Присоединение: вирусный спайковый белок (S) представляет собой гибридный белок, который претерпевает существенную структурную перестройку для слияния вирусной мембраны с мембраной клетки-хозяина. Этот процесс запускается, когда субъединица S1 связывается с рецептором клетки-хозяина. Связывание с рецептором дестабилизирует спайковый белок, что приводит к выделению субъединицы S1 и переходу субъединицы S2 в стабильную конформацию после слияния. На уровне белка для взаимодействия с рецептором клетки-хозяина рецепторсвязывающий домен (RBD) S1 претерпевает шарообразные конформационные движения, которые переключаются между подтверждением вниз, которое соответствует состоянию, недоступному для рецептора, и подтверждением вверх, которое соответствует Рецептор доступного состояния.

Примирование: В дополнение к структурным изменениям для примирования S-белка требуется последовательное расщепление S-белка в двух местах клеточными протеазами. Проникновение вируса требует расщепления белка S в сайтах протеолитического расщепления S1 / S2, а затем субъединица S2 позволяет осуществлять слияние вирусных и клеточных мембран.

Поглощение: SARS-CoV-2 использует эндосомальные цистеиновые протеазы катепсина B и L (CatB / L) для поглощения РНК-механизма в клетки-мишени после прикрепления к рецептору ACE2 и всех необходимых изменений конформации. Катепсин B и L также могут стать терапевтическими мишенями.

Известно, что клинически изученный и используемый камостат с ингибитором сериновой протеазы обладает активностью против TMPRSS2 и частично блокирует проникновение вируса S-белка в клетки легких Calu-3 во время исследования in vitro. Полное ингибирование было достигнуто с добавлением экспериментального соединения под названием E-64d вместе с камостатом. E-64d использовался в качестве лизосомального ингибитора (только в лабораторных условиях) в качестве ингибитора CatB / L 4.

Агенты, блокирующие IL-6: IL-6 является критическим цитокином, лежащим в основе гипер-воспалительных реакций. Таколизумаб и сарилумаб - два препарата, рассматриваемые для блокады IL-6, чтобы ослабить сверхактивные воспалительные реакции в легких у тех, кто серьезно инфицирован COVID-19. Таколизумаб был опробован в качестве экспериментального лечения в РКИ для синдрома высвобождения цитокинов, и результаты показали быстрое снижение лихорадки, и 75% (15 из 20) пациентов испытывали снижение потребности в дополнительном кислороде. Испытания сарилумаба просто не начинаются в больницах в Нью-Йорке. Существует значительное количество доказательств того, что у подгруппы пациентов с тяжелой формой COVID-19 развивается цитокиновый шторм и, в частности, приобретается вторичный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз. Вторичный гемофагоцитарный лимфогистиоцитоз (sHLH) представляет собой гипервоспалительный синдром, характеризующийся молниеносной и фатальной гиперцитокинемией с полиорганной недостаточностью. Ключевые особенности sHLH включают постоянную лихорадку, цитопению, гиперферринемию и поражение легких (включая ОРДС). Профиль цитокинов, напоминающий sHLH, связан с тяжелым заболеванием COVID-19, характеризующимся повышенным уровнем интерлейкина (IL) -2, IL-7, гранулоцитарно-колониестимулирующего фактора, белка, индуцируемого интерфероном-γ 10, и фактора некроза опухоли-α среди других. Все эти цитокины являются маркерами воспаления в острой фазе, которые остаются постоянно повышенными у пациентов с тяжелой формой COVID-19. Таким образом, все пациенты с тяжелой формой COVID-19 должны проходить скрининг на наличие гипервоспаления с использованием лабораторных тенденций (например, увеличение ферритина, уменьшение количества тромбоцитов или скорость оседания эритроцитов) и HScore. Управление цитокиновым штормом включает лечение стероидами, внутривенным иммуноглобулином, селективную блокаду цитокинов (например, сарилумаб или тоцилизумаб) и ингибирование JAK 5.

Рекомбинантный ACE2 Концепция использования рекомбинантного ACE2 заключается в том, чтобы действовать как нейтрализующее антитело. Из структурных исследований мы знаем, что SARS-CoV-2 связывается с ACE2 и использует его в качестве рецептора входа. Поставка экзогенного ACE2 может поглощать вирус и предотвращать его связывание с каноническим рецептором клеток-мишеней человека. Это уменьшит вирусную нагрузку, потому что вирус больше не может свободно проникать в клетки, и уменьшит тяжесть заболевания у особенно уязвимых групп пациентов. Эта стратегия может также использовать преимущества других структурных компонентов. Например, вирусный спайк-белок имеет рецептор-связывающий домен (RBD), рекомбинантный RBD также может перенаправлять вирус из связывающихся клеток человека. На практике использование иммуноадгезинного подхода, при котором подобная антителам молекула может нейтрализовать проникновение вируса в клетки, было бы самым простым и самым прямым решением. Другим потенциальным преимуществом использования рекомбинантного ACE2 является то, что он может быть накоплен для будущих вспышек SARS и 2019-nCoV или любого нового мутированного коронавируса, появляющегося из зоонозного резервуара, который использует рецептор ACE2 для входа 6.

Наконец, давайте поговорим об использовании ACE / ARB для снижения вирусной нагрузки. Это активно обсуждаемая тема с большим количеством предположений о людях. Для начала, мы знаем, что на моделях мышей с нокаутированным рецептором ACE2 инфицирование вирусом гриппа H7N9 приводит к повсеместно ухудшающейся патологии легких и плохим результатам выживания. Сообщество nephJC дает нам отличное резюме физиологии здесь:

Рецептор ангиотензина (AT1) и ACE2 физически взаимодействуют с образованием комплексов на клеточной мембране в отсутствие избытка Ang II (левая панель). Это может потенциально уменьшить взаимодействие вируса с ACE2 (полное предположение)
Введение Ang II уменьшает физическое взаимодействие между ACE2 и рецептором AT1. Также индуцирует убиквитинирование ACE2 с последующей интернализацией и лизосомальной деградацией.
Антагонизм рецептора AT1 с лозартаном предотвращал интернализацию, деградацию и убиквитинирование ACE2.
Если взаимодействие вирусного белка с ACE2 в рецепторных комплексах ACE2-AT1 снижается, ARB могут оказаться полезными. Введение ARB может (теоретически) стабилизировать взаимодействие рецептора ACE2-AT1 и предотвратить взаимодействие и интернализацию вирус-белок-ACE2.
В целом, большинство мутаций, приобретенных SARS-CoV-2, не являются продуктивными. Однако, есть ранние свидетельства того, что мутации усиления функции ORF8 диверсифицируют вирулентность. ↩

Для всех практических целей разработки лекарств ACE2 по-прежнему считается основным рецептором проникновения вируса. Эта предварительная компьютерная печать утверждает, что, поскольку ACE2 не очень высоко экспрессируется в легочной ткани, должно быть больше генов, которые играют ключевую роль в проникновении SARS-CoV-2 в клетки человека. ↩

Здесь представлен более полный обзор РНК-зависимых РНК-полимераз, а также даны более подробные сведения о SARS-полимеразе.

E-64d был изучен в контексте черепно-мозговой травмы (ЧМТ) и болезни Альцгеймера. ↩

Ингибирование янус-киназы (JAK) может влиять как на пути воспаления (приводящие к подавлению воспалительного ответа), так и на проникновение клеточного вируса в COVID-19.

Считается, что лабораторное тестирование и коммерциализация легче для рекомбинантного антитела ACE2.